活菌數(shù)是益生菌產(chǎn)品的重要屬性之一，因?yàn)榛罹鷶?shù)可能會(huì)影響益生菌產(chǎn)品的效果?；罹鷶?shù)不僅對(duì)于益生菌企業(yè)和消費(fèi)者具有重要的意義，對(duì)于監(jiān)管部門(mén)而言也十分重要。

　　那么活菌數(shù)要怎么檢測(cè)呢？除了平板培養(yǎng)以外，還有什么其他方法嗎？

　　今天，我們共同關(guān)注活菌數(shù)的檢測(cè)，希望本文能夠?yàn)橄嚓P(guān)的產(chǎn)業(yè)人士和諸位讀者帶來(lái)一些啟發(fā)和幫助。

　　活菌檢測(cè)

　　目前，益生菌行業(yè)公認(rèn)的益生菌定義，是 2001 年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合工作組提出的：益生菌是指當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí)，會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生健康益處的活性微生物1。因此，根據(jù)定義，“活性”是益生菌的一個(gè)重要特性。

　　此外，我國(guó) 2005 年發(fā)布的《益生菌類(lèi)保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定（試行）》中第十二條也明確規(guī)定了，活菌類(lèi)益生菌保健食品在其保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)目不得少于106CFU/mL(g)。

　　因此，準(zhǔn)確測(cè)定益生菌產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，對(duì)生產(chǎn)商和消費(fèi)者，以及監(jiān)管部門(mén)來(lái)說(shuō)，都意義重大。

　　目前，我國(guó)益生菌行業(yè)主要依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-乳酸菌檢驗(yàn) GB4789.35—2016》對(duì)活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。該標(biāo)準(zhǔn)采用了培養(yǎng)法來(lái)檢測(cè)食品中的活菌數(shù)。

　　不過(guò)隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，當(dāng)前出現(xiàn)了一些檢測(cè)活菌數(shù)量的新方法，其中一些方法具有一定的應(yīng)用前景，有機(jī)會(huì)在未來(lái)廣泛應(yīng)用于益生菌產(chǎn)品的活菌檢測(cè)。今天，我們將介紹幾種用于活菌檢測(cè)方法，并探討不同方法的優(yōu)劣之處。

　　基于分離培養(yǎng)

　　平板計(jì)數(shù)

　　平板菌落計(jì)數(shù)法是指將樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪B續(xù)稀釋后，取一定量的稀釋樣液涂布到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)菌落形成單位（CFU）進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到現(xiàn)存活菌數(shù)量的估計(jì)值，并表示為每克或毫升原始樣本的菌落形成單位的方法3。

　　該方法的關(guān)鍵在于恰當(dāng)?shù)脑紭悠返南♂尡稊?shù)——將培養(yǎng)后的細(xì)菌菌落控制在 30-300 個(gè)為宜。

　　這種活菌檢測(cè)的方法，是當(dāng)前應(yīng)用廣泛、經(jīng)典的微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，除了被應(yīng)用于檢測(cè)食品中的活菌數(shù)，它還常常被用于水質(zhì)的檢測(cè)4。該方法具有成本低、易操作的巨大優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也有一定的局限性。

　　平板菌落計(jì)數(shù)法存在耗時(shí)長(zhǎng)，難以應(yīng)付生長(zhǎng)緩慢、活的“不可培養(yǎng)的”微生物的缺點(diǎn)。不僅如此，隨著益生菌相關(guān)研究的不斷深入，未來(lái)將出現(xiàn)越來(lái)越多樣的微生物菌種（菌株），對(duì)于這些沒(méi)有培養(yǎng)過(guò)的菌株，試驗(yàn)條件都需要摸索與嘗試。

　　除此之外，該方法測(cè)定的結(jié)果是總活菌數(shù)量，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分益生菌產(chǎn)品中不同菌株細(xì)菌的活菌數(shù)目，而當(dāng)前越來(lái)越多的益生菌產(chǎn)品采用多菌株，因此急需其他活菌檢測(cè)方法來(lái)彌補(bǔ)上述缺陷。

　　基于基因表達(dá)活性

　　qPCR

　　轉(zhuǎn)錄組可以反映出微生物的活力狀態(tài)，因此，當(dāng)前有一些研究人員開(kāi)始嘗試?yán)眉?xì)菌的信使 RNA（mRNA），來(lái)測(cè)定活菌數(shù)目。

　　定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-qPCR）是一種用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄情況的常見(jiàn)研究方法。在該方法中，信使 RNA（mRNA）先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ) DNA（cDNA）。隨后，以 cDNA 為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。因此，我們可以選取微生物特定基因的 mRNA 作為檢測(cè)靶標(biāo)，利用該方法對(duì)樣品中的活菌數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。

　　為提高基于 mRNA 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，RT-qPCR 可與疊氮碘化丙錠染色（PMA，可選擇性標(biāo)記死細(xì)胞）和 16S rRNA 測(cè)序等技術(shù)聯(lián)用5，設(shè)置死菌陽(yáng)性對(duì)照組，區(qū)分出活菌。

　　目前已有一些文獻(xiàn)采用這種方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，比如廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中的糞腸球菌6。

　　此種基于基因表達(dá)活性的檢測(cè)方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的優(yōu)勢(shì)；但樣品制備過(guò)程中的微小變化，都會(huì)影響終的測(cè)定結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作人員的要求較高。同時(shí)，還需要根據(jù)不同的微生物，制定不同的檢測(cè)靶標(biāo)和對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

　　圖.流式細(xì)胞儀

　　流式細(xì)胞分選技術(shù)

　　隨著技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞分選技術(shù)已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)手段之一。在染色或熒光標(biāo)記的基礎(chǔ)上，可以使用流式細(xì)胞分選技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

　　流式細(xì)胞分選技術(shù)是一種利用高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)將發(fā)光顆粒亞群分開(kāi)，并可實(shí)現(xiàn)單克隆分選，從而對(duì)復(fù)雜樣本中的細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)、定量和分離。

　　流式細(xì)胞分選技術(shù)具有精確度高，速度快，允許一次檢測(cè)大量細(xì)菌，可對(duì)不同的細(xì)菌進(jìn)行分選，檢測(cè)活菌不同的生理活性和細(xì)菌大小的優(yōu)勢(shì)7。

　　但由于流式細(xì)胞分選技術(shù)復(fù)雜昂貴，目前主要應(yīng)用于科學(xué)研究，尚未普遍用于益生菌產(chǎn)品的活菌數(shù)檢驗(yàn)，不過(guò)國(guó)外已有以此作為出廠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的先例。

　　圖.拉曼光譜結(jié)合人工智能快速鑒定微生物

　　拉曼光譜檢測(cè)方法

　　1928 年，在研究單色光穿過(guò)透明液體介質(zhì)時(shí)，印度物理學(xué)家 C.V. Raman 次發(fā)現(xiàn)，入射光中很少一部分光子，與介質(zhì)產(chǎn)生了非彈性碰撞，即入射光照射在介質(zhì)上時(shí)，與介質(zhì)的分子或原子發(fā)生了能量交換，散射出來(lái)的光與入射光的振動(dòng)頻率不同——這就是著名的拉曼光譜效應(yīng)。

　　在這一理論基礎(chǔ)上，發(fā)展起來(lái)的分析技術(shù)被稱(chēng)為拉曼光譜技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于液體、氣體和固體的檢測(cè)，且可獲得振動(dòng)頻率為 50-4000cm-1的分子指紋信息8。因此，它已被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域的化學(xué)及生物分子的鑒定與研究中，如食品檢測(cè)、生物醫(yī)藥、環(huán)境衛(wèi)生和石油化工等。

　　拉曼光譜技術(shù)也可用于活菌計(jì)數(shù)。有研究人員曾利用活菌與死菌表面電荷的不同，在活菌表面吸附銀離子后進(jìn)行還原，測(cè)試其拉曼增強(qiáng)信號(hào)，結(jié)果顯示經(jīng)完全滅活的細(xì)菌，幾乎沒(méi)有拉曼增強(qiáng)信號(hào)，而活菌表面的拉曼增強(qiáng)信號(hào)，則非常豐富，以此來(lái)辨別活菌9。

　　還有研究人員將分離培養(yǎng)與拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，以重水制備的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)沙門(mén)氏菌，進(jìn)行氘元素標(biāo)記，并與共聚焦顯微拉曼光譜聯(lián)用，以氘元素特征拉曼光譜峰，監(jiān)測(cè)區(qū)分沙門(mén)氏菌為死菌還是活菌10。

　　該技術(shù)可從分子水平上，精確反映樣品的化學(xué)成分組成和分子結(jié)構(gòu)差異，并且表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)、共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)的出現(xiàn)，使得其在分析鑒定過(guò)程中，更加直觀、易于觀察和控制，并且結(jié)果更加顯著，這些優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展。

　　不過(guò)由于該技術(shù)還在研究之中，所以仍有一些問(wèn)題需要克服。比如該技術(shù)難以區(qū)分不同組分拉曼峰的疊加，易出現(xiàn)某些待測(cè)物質(zhì)峰被掩蓋，造成某些組分信息不能完全展現(xiàn)，從而影響終結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　目前，有許多研究人員正在積極克服這些局限性，推動(dòng)拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用，并認(rèn)為該方法有望成為替代培養(yǎng)法的新一代活菌數(shù)檢測(cè)方法。

　　其他方法

　　細(xì)菌的產(chǎn)物

　　除了拉曼光譜之外，還有一些新型的檢測(cè)活菌的方法。益生菌在生長(zhǎng)和發(fā)酵過(guò)程中，可能會(huì)分泌一些物質(zhì)或放出一些氣體，在這些生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，也可以通過(guò)檢測(cè)活菌產(chǎn)生的分泌物或氣體的量，間接確定活菌的數(shù)目。

　　潛在的可用于活菌檢測(cè)的分泌物有：III 型分泌蛋白 SpaO、蛋白質(zhì)前體易位酶等11。

　　此外，一些益生菌會(huì)產(chǎn)生短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì)，使樣品的 pH 值降低，用溴甲酚紫、酚酞、硝基酚等作為 pH 指示劑，或利用高精度的 pH 計(jì)，檢測(cè) pH 值的變化量，從而換算出產(chǎn)酸量，并推算出活菌數(shù)目12。

　　這類(lèi)新型的檢測(cè)方法想象空間巨大，但目前仍然很不成熟，并且利用生物標(biāo)記物區(qū)分死活菌的標(biāo)準(zhǔn)仍不全面。但是，相信在不久的將來(lái)，這些活菌檢測(cè)手段會(huì)逐漸成熟，為我們檢測(cè)活菌數(shù)提供更多的可能。